Nyckelskillnad - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
DNA-sekvensering är mycket viktigt för DNA-analys eftersom kunskap om rätt nukleotidarrangemang på en viss DNA-region avslöjar många viktiga uppgifter om den. Det finns olika DNA-sekvenseringsmetoder. Sanger-sekvensering och pyrosekvensering är två olika DNA-sekvenseringsmetoder som ofta används inom molekylärbiologi. Nyckelskillnaden mellan Sanger-sekvensering och pyrosekvensering är att Sanger-sekvensering använder dideoxynukleotider för att avsluta syntesen av DNA för att läsa nukleotidsekvensen medan pyrosekvensering detekterar pyrofosfatfrisättningen genom att införliva nukleotiderna och syntetisera den komplementära sekvensen för att läsa den exakta ordningen på sekvensen.
INNEHÅLL
1. Översikt och nyckeldifferens
2. Vad är Sanger-sekvensering
3. Vad är pyrosekvensering
4. Jämförelse sida vid sida - Sanger-sekvensering vs Pyrosekvensering
5. Sammanfattning
Vad är Sanger Sequencing?
Sanger-sekvensering är en första generationens DNA-sekvenseringsmetod som utvecklats av Frederick Sanger och hans högskolor 1977. Det är också känt som Chain Termination Sequencing eller Dideoxy-sekvensering eftersom det är baserat på kedjeterminering av dideoxynukleotider (ddNTP). Denna metod användes i stor utsträckning i mer än 30 år tills New Generation Sequencing (NGS) utvecklades. Sanger-sekvenseringsteknik möjliggjorde upptäckten av den korrekta nukleotidordningen eller bindningen av ett visst DNA-fragment. Den är baserad på selektiv införlivande av ddNTP och avslutande av DNA-syntes under DNA-replikering in vitro. Frånvaron av 3'OH-grupper för att fortsätta fosfodiesterbindningsbildningen mellan intilliggande nukleotider är ett unikt särdrag hos ddNTP. Följaktligen, när ddNTP är ansluten, upphör kedjeförlängningen och slutar från den punkten. Det finns fyra ddNTP: er - ddATP, ddCTP, ddGTP och ddTTP - som används i Sanger-sekvensering. Dessa nukleotider stoppar DNA-replikationsprocessen när de införlivas i den växande DNA-strängen och resulterar i varierande längder av kort DNA. Kapillärgelelektrofores används för att organisera dessa korta DNA-strängar efter deras storlek på en gel som visas i figur 01.
Figur 1: kapillärgelelektrofores av syntetiserat kort DNA
För in vitro-replikering av DNA bör få krav ställas. De är DNA-polymerasenzym, mall-DNA, oligonukleotidprimrar och deoxinukleotider (dNTP). I Sanger-sekvensering utförs DNA-replikering i fyra separata provrör tillsammans med fyra typer av ddNTP separat. Deoxinukleotider ersätts inte helt av respektive ddNTP. En blandning av det specifika dNTP (till exempel; dATP + ddATP) ingår i röret och replikeras. Fyra separata rörprodukter körs på en gel i fyra separata brunnar. Sedan genom att läsa gelen kan sekvensen konstrueras som visas i figur 02.
Figur 02: Sanger-sekvensering
Sanger-sekvensering är en viktig teknik som hjälper inom många områden av molekylärbiologi. Mänskligt genomprojekt slutfördes framgångsrikt med hjälp av Sanger-sekvenseringsbaserade metoder. Sanger-sekvensering är också användbar vid mål-DNA-sekvensering, forskning om cancer och genetisk sjukdom, genuttrycksanalys, mänsklig identifiering, patogendetektion, mikrobiell sekvensering etc.
Det finns flera nackdelar med Sanger-sekvensering:
- Längden på DNA som sekvenseras kan inte vara längre än 1000 baspar
- Endast en sträng kan sekvenseras åt gången.
- Processen är tidskrävande och dyr.
Därför utvecklades nya avancerade sekvenseringstekniker med tiden för att övervinna dessa problem. Sanger-sekvensering används emellertid fortfarande på grund av dess mycket noggranna resultat upp till cirka 850 basparlängdsfragment.
Vad är Pyrosequencing?
Pyrosekvensering är en ny DNA-sekvenseringsteknik baserad på "sekvensering genom syntes". Denna teknik är beroende av detektering av pyrofosfatfrisättning vid nukleotidinkorporeringen. Processen används av fyra olika enzymer: DNA-polymerse, ATP-sulfurylas, luciferas och apyras och två substrat adenosin 5'-fosfosulfat (APS) och luciferin.
Processen börjar med primerbindningen med den enkelsträngade DNA-mallen och DNA-polymeras startar införlivandet av nukleotider som är komplementära till den. När nukleotiderna går ihop (nukleinsyrapolymerisation) frigör det pyrofosfat (två fosfatgrupper bundna ihop) grupper och energi. Varje nukleotidtillsats frigör ekvimolär mängd pyrofosfat. Pyrofosfat omvandlas till ATP av ATP-sulfurylas i närvaro av substrat APS. Den genererade ATP driver den luciferasmedierade omvandlingen av luciferin till oxyluciferin, vilket ger synligt ljus i mängder som är proportionella mot mängden ATP. Ljus detekteras av en fotondetekteringsenhet eller av fotomultiplikator och skapar ett pyrogram. Apyrase bryter ner ATP och icke-införlivade dNTP i reaktionsblandningen. dNTP-tillägg görs en gång i taget. Eftersom tillsatsen av nukleotid är känd enligt införlivandet och detekteringen av ljus kan mallens sekvens bestämmas. Pyrogram används för att generera nukleotidsekvensen för prov-DNA som visas i figur 03.
Pyrosekvensering är mycket viktig vid analys av enkel nukleotidpolymorfism och sekvensering av korta DNA-sträckor. Den höga noggrannheten, flexibiliteten, lättheten vid automatisering och parallell bearbetning är fördelarna med pyrosekvensering framför Sanger-sekvenseringstekniker.
Figur 03: Pyrosekvensering
Vad är skillnaden mellan Sanger Sequencing och Pyrosequencing?
Skilja artikeln mitt före bordet
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Sanger-sekvensering är en DNA-sekvenseringsmetod baserad på selektiv införlivande av ddNTP med DNA-polymeras och kedjeterminering. | Pyrosekvensering är en DNA-sekvenseringsmetod baserad på detektering av pyrofosfatfrisättning vid införlivande av nukleotid. |
| Användning av ddNTP | |
| ddNTP används för att avsluta DNA-replikationen | ddNTP används inte. |
| Inblandade enzymer | |
| DNA-polymeras används. | Fyra enzymer används: DNA-polymeras, ATP-sulfurylas, Luciferas och Apyras. |
| Underlag används | |
| APS och Luciferin används inte. | Adenosin 5'-fosfosulfat (APS) och luciferin används. |
| Max temperatur | |
| Detta är en långsam process. | Detta är en snabb process. |
Sammanfattning - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger-sekvensering och pyrosekvensering är två DNA-sekvenseringsmetoder som används i molekylärbiologi. Sanger-sekvensering konstruerar ordningen av nukleotiderna i sekvens genom att avsluta kedjeförlängningen medan pyrosekvenseringen konstruerar den exakta ordningen för nukleotiderna i sekvens genom införlivande av nukleotider och detektering av frisättningen av pyrofosfater. Därför är den huvudsakliga skillnaden mellan Sanger-sekvensering och Pyrosekvensering att Sanger-sekvensering fungerar på sekvensering genom kedjetermination medan pyrosekvensering fungerar på sekvensering genom syntes.
