Nyckelskillnad - NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) och Sanger Sequencing är två typer av nukleotidsekvenseringstekniker som utvecklats över tiden. Sanger Sequencing-metoden användes ofta i många år och NGS ersatte den nyligen på grund av dess fördelar. Huvudskillnaden mellan NGS och Sanger Sequencing är att NGS arbetar på principen att sekvensera miljontals sekvenser samtidigt på ett snabbt sätt genom ett sekvenseringssystem medan Sanger Sequencing fungerar på principen om kedjeterminering på grund av selektiv inkorporering av dideoxynukleotider av DNA-polymerasenzym under DNA-replikering och resulterande fragmentseparation genom kapillärelektrofores.
INNEHÅLL
1. Översikt och nyckeldifferens
2. Vad är nukleotidsekvensering
3. Vad är NGS
4. Vad är Sanger-sekvensering
5. Jämförelse sida vid sida - NGS vs Sanger-sekvensering
6. Sammanfattning
Vad är nukleotidsekvensering?
Genetisk information lagras i nukleotidsekvenserna av DNA eller RNA i en organism. Processen för att bestämma den korrekta ordningen av nukleotider (med användning av fyra baser) i ett givet fragment (i en gen, grupp av gener, kromosom och fullständigt genom) är känd som nukleotidsekvensering. Det är mycket viktigt i genomstudier, kriminaltekniska studier, virologi, biologisk systematisk, medicinsk diagnos, bioteknik och inom många andra områden att analysera generens struktur och funktion. Det finns olika typer av sekvenseringsmetoder som utvecklats av forskare. Bland dem användes Sanger-sekvensering utvecklad av Frederick Sanger 1977 och populariserades under lång tid tills Next Generation Sequencing ersatte den.
Vad är NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) är en term som används för att hänvisa till moderna sekvenseringsprocesser med hög kapacitet. Den beskriver ett antal olika moderna sekvenseringstekniker som revolutionerade genomstudier och molekylärbiologi. Dessa tekniker är Illumina-sekvensering, Roche 454-sekvensering, Ion-protonsekvensering och SOLiD-sekvensering (sekvensering med Oligo-ligeringsdetektion). NGS-system är snabbare och billigare. Fyra huvudsakliga DNA-sekvenseringsmetoder används i NGS-system, nämligen; pyrosekvensering, sekvensering genom syntes, sekvensering genom ligering och jonhalvledarsekvensering. Ett stort antal DNA- eller RNA-strängar (miljoner) kan sekvenseras parallellt. Det möjliggör sekvensering av hela genomet av organismer inom en kort tidsperiod, till skillnad från Sanger-sekvensering som tar mer tid.
NGS har många fördelar jämfört med konventionell Sanger-metod. Det är en snabbare, mer exakt och kostnadseffektiv process som kan utföras med en liten provstorlek. NGS kan användas i metagenomiska studier, vid detektering av variationer inom ett enskilt genom på grund av insertioner och borttagningar etc. och i analysen av genuttryck.
Figur_1: Utveckling av NGS-sekvensering
Vad är Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing är en sekvenseringsmetod som utvecklades av Frederick Sanger och hans kollegor 1977 för att bestämma den exakta nukleotidordningen för ett givet DNA-fragment. Det är också känt som kedjetermineringssekvensering eller Dideoxy-sekvensering. Arbetsprincipen för denna metod är avslutningen av strandsyntes genom selektiv inkorporering av en kedja som avslutar dideoxynukleotider (ddNTP) såsom ddGTP, ddCTP, ddATP och ddTTP med DNA-polymeras under replikering av DNA. Normala nukleotider har 3'OH-grupper för bildning av en fosfodiesterbindning mellan intilliggande nukleotider för att fortsätta strängbildningen. DdNTP saknar emellertid denna 3'-OH-grupp och kan inte bilda fosfodiesterbindningar mellan nukleotider. Därför upphör kedjeförlängningen.
I denna metod tjänar det enkelsträngade DNA som skall sekvenseras som mallsträng för in vitro DNA-syntes. Andra krav är oligonukleotidprimer, deoxinukleotidprekursorer och DNA-polymerasenzym. När de flankerande ändarna av målfragmentet är kända kan primers enkelt utformas för DNA-replikering. Fyra separata DNA-syntesreaktioner utförs i fyra separata rör. Varje rör har separata ddNTP, tillsammans med andra krav. Från den specifika nukleotiden tillsätts en blandning av dNTP och ddNTP. På samma sätt utförs fyra separata reaktioner i fyra rör med fyra blandningar. Efter reaktionerna utförs detektering av DNA-fragment och omvandling av fragmentmönstret till sekvensinformation. Resulterande DNA-fragment värmedenatureras och separeras med gelelektrofores. Om radioaktiva nukleotider används kan bandmönstret i polyakrylamidgeln visualiseras genom autoradiografi. När den här metoden använder de fluorescerande taggade dideoxynukleotiderna, kan den lindras ner i gelavläsningen och passeras genom en laserstråle som detekteras av den fluorescerande detektorn. För att undvika fel som kan uppstå när en sekvens läses av ögat och går in manuellt i en dator, utvecklades denna metod för användning av automatiserad sequencer i kombination med datorn. För att undvika fel som kan uppstå när en sekvens läses av ögat och matas in manuellt i en dator utvecklades denna metod till användning av automatiserad sequencer i kombination med datorn. För att undvika fel som kan uppstå när en sekvens läses av ögat och matas in manuellt i en dator utvecklades denna metod till användning av automatiserad sequencer i kombination med datorn.
Detta är metoden som används för att sekvensera DNA från Human Genome-projektet. Denna metod används fortfarande med avancerade modifieringar eftersom den ger korrekt sekvensinformation trots att det är en dyr och långsam process.
Figur_2: Sanger-sekvensering
Vad är skillnaden mellan NGS och Sanger Sequencing?
Skilja artikeln mitt före bordet
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Nästa generations sekvensering (NGS) hänvisar till moderna sekvenseringsprocesser med hög kapacitet. Den beskriver ett antal olika moderna sekvenseringstekniker | Sanger Sequencing är en sekvenseringsmetod som utvecklats av Frederick Sanger för att bestämma den exakta nukleotidordningen för ett givet DNA-fragment. |
| Kostnadseffektivitet | |
| NGS är en billigare process eftersom det minskar tid, människans kraft och kemikalier. | Detta är en kostsam process eftersom det tar tid, människokraft och fler kemikalier. |
| Hastighet | |
| Detta är snabbare eftersom både kemisk detektion och signaldetektering av många strängar sker parallellt. | Detta är tidskrävande eftersom kemisk detektering och signaldetektering sker som två separata processer och endast på sträng kan läsas åt gången. |
| Pålitlighet | |
| NGS är pålitlig. | Sanger-sekvensering är mindre tillförlitlig |
| Provstorlek | |
| NGS kräver mindre mängd DNA. | Denna metod kräver en stor mängd mall-DNA. |
| DNA-baser per sekvenserat fragment | |
| Antalet DNA-baser per sekvenserat fragment är lägre än Sanger-metoden | Genererande sekvenser är längre än NGS-sekvenser. |
Sammanfattning - NGS vs Sanger Sequencing
NGS och Sanger Sequencing är nukleotidsekvenseringstekniker som i stor utsträckning används i molekylärbiologi. Sanger-sekvensering är en tidig sekvenseringsmetod som ersattes av NGS. Huvudskillnaden mellan NGS och Sanger Sequencing är att NGS är en snabbare, mer exakt och kostnadseffektiv process än Sanger-sekvensering. Båda teknikerna skapade stora utbrott inom genetik och bioteknik.
