Nyckelskillnad - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotider är de grundläggande strukturella enheterna och byggstenarna i DNA. DNA-molekyl består av en polynukleotidkedja. Det finns fyra olika nukleotider som finns i DNA. Dessa nukleotider består av fyra olika kvävebaser med namnet A (adenin), G (guanin), C (cytosin), T (tymin). Nukleotidernas ordning i DNA-molekylen har stor betydelse eftersom den kodar för en viktig genetisk information för organismernas tillväxt och utveckling. DNA-sekvensering avser processen som bestämmer DNA: s exakta nukleotidsekvens. Det finns olika DNA-sekvenseringsmetoder. Maxam Gilbert-sekvensering och Sanger DNA-sekvensering är två metoder för DNA-sekvensering som tillhör första generationens sekvensering. Maxam Gilbert-sekvenseringsförfarandet bestämmer bassekvensen genom att kemiskt klyva de 5'-märkta DNA-fragmenten företrädesvis vid var och en av fyra nukleotider och gelelektrofores. Sanger-sekvenseringsförfarande bestämmer nukleotidsekvensen genom syntetisering av enkelsträngat DNA med användning av DNA-polymeras och dideoxynukleotider och gelelektrofores. Detta är nyckelskillnaden mellan Maxam Gilbert och Sanger Sequencing.
INNEHÅLL
1. Översikt och nyckelskillnad
2. Vad är Maxam Gilbert
3. Vad är Sanger-sekvensering
4. Jämförelse vid sida - Maxam Gilbert vs Sanger-sekvensering
5. Sammanfattning
Vad är Maxam Gilbert Sequencing?
Maxam Gilbert-sekvensering, även känd som kemisk sekvenseringsmetod, är en teknik som utvecklades för att bestämma nukleotidernas ordning i DNA. Denna metod introducerades av Walter Gilbert och Alan Maxam 1976 och blev populär eftersom den kan utföras direkt med renat DNA. Maxam Gilbert-metoden tillhör den första generationen av DNA-sekvensering, och det var den första sekvenseringsmetoden som används allmänt av forskare.
Den grundläggande principen för denna metod ligger i begränsningen av de slutmärkta DNA-fragmenten vid specifika baser genom basspecifika kemikalier och betingelser och separering av de märkta fragmenten genom elektrofores såsom visas i figur 01. Fragment separeras enligt deras storlekar på gel. Eftersom fragmenten är märkta kan DNA-molekylens sekvens lätt härledas.
Maxam gilbert-metoden använder basspecifika kemikalier för att bryta DNA vid specifika baser. Två vanliga kemikalier med namnet dimetylsulfat och hydrazin-kemikalier används för att selektivt angripa puriner respektive pyrimidiner.
Maxam Gilbert sekvenseringsmetod utförs via flera steg enligt följande.
- Rening av DNA-sekvensen med restriktionsendonukleaser
- Märkning av ändarna av DNA-fragmenten genom tillsats av radioaktiva fosfater
- Rening av de märkta fragmenten från icke-märkta fragment med gelelektrofores
- Separation av det slutmärkta DNA i fyra rör och behandling med basspecifika kemikalier separat
- Elektrofores av innehållet i varje rör på separata linjer på en gel- och fragmentseparation enligt deras längd.
- Detektion av fragmenten med autoradiograf.
Figur 01: Maxam Gilbert-sekvensering
Vad är Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing är en sekvenseringsmetod som utvecklades av Frederick Sanger och hans kollegor 1977 för att bestämma bassekvensen för ett givet DNA-fragment. Det är också känt som kedjetermineringssekvensering eller Dideoxy-sekvenseringsmetod. Denna metod fungerar på principen om selektiv införlivande av kedjeterminerande dideoxynukleotider (ddNTP) såsom ddGTP, ddCTP, ddATP och ddTTP med DNA-polymeras under syntesen av enkelsträngat DNA för att avsluta strängbildning. Dideoxynukleotider saknar 3'OH-grupper för bildandet av fosfodiesterbindningar med intilliggande nukleotid. Följaktligen stoppar strängbildningen när en ddNTP införlivas i nybildande sträng under sanger-sekvensering.
I denna metod utförs fyra separata DNA-syntesreaktioner (PCR) i fyra separata rör med en typ av ddNTP. Andra krav tillhandahålls också för rören för PCR inklusive primers, dNTP, Taq-polymeras, specifika betingelser etc. Fyra separata reaktioner utförs i fyra rör med fyra blandningar. Efter PCR-reaktioner värmedenatureras resulterande DNA-fragment och separeras med gelelektrofores. Därefter visualiseras fragmenten genom att använda antingen en märkt (radioaktiv eller fluorescerande) primer eller dNTP som visas i figur 02.
Figur 02: Sanger-sekvensering
Vad är skillnaden mellan Maxam Gilbert och Sanger Sequencing?
Skilja artikeln mitt före bordet
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Maxam Gilbert-sekvensering är den första tekniken som utvecklats för DNA-sekvensering. | Sanger-sekvenseringsmetod introducerades efter Maxam Gilbert-sekvenseringsmetoden. |
| Användande | |
| Denna metod används sällan. | Sanger-sekvensering används rutinmässigt för sekvensering. |
| Användning av farliga kemikalier | |
| Det använder farliga kemikalier. | Användningen av farliga kemikalier är begränsad jämfört med Maxam Gilbert-metoden. |
| Märkning för upptäckt | |
| Denna metod använder radioaktivt P 32 för märkning av ändarna av DNA-fragmenten. | Sanger-sekvensering använder radioaktivt eller fluorescerande märkta ddNTP. |
Sammanfattning - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert och Sanger-sekvensering är två typer av DNA-sekvenseringstekniker som omfattas av första generationens DNA-sekvensering. Maxam Gilbert-sekvensering är den första metoden som infördes för DNA-sekvensering 1976, och den utförs genom att bryta de ändmärkta DNA-fragmenten med basspecifika kemikalier. Därför är det känt som kemisk sekvensering. Sanger-sekvenseringsmetod introducerades 1977 och är baserad på ddNTP-drivna kedjetermineringsreaktioner. Sanger-sekvenseringsmetod populär än Maxam Gilbert-metoden på grund av flera nackdelar med Maxam Gilbert-metoden, såsom överdriven tidsförbrukning, användning av farliga kemikalier etc. Detta är skillnaden mellan Maxam Gilbert och Sanger-sekvensering.
