Nyckelskillnad - PCR vs DNA-sekvensering
PCR och DNA-sekvensering är två viktiga tekniker inom molekylärbiologi. Polymeraskedjereaktion (PCR) är processen som skapar ett stort antal kopior av ett DNA-fragment. DNA-sekvensering är tekniken som resulterar i den exakta ordningen på nukleotiderna i ett givet DNA-fragment. Detta är nyckelskillnaden mellan PCR och DNA-sekvensering. PCR är ett av de viktigaste stegen i DNA-sekvensering.
INNEHÅLL
1. Översikt och nyckelskillnad
2. Vad är PCR
3. Vad är DNA-sekvensering
4. Jämförelse sida vid sida - PCR vs DNA-sekvensering
5. Sammanfattning
Vad är PCR?
Polymeraskedjereaktion (PCR) är en DNA-amplifieringsteknik som används i molekylärbiologi. Det producerar tusentals till miljoner kopior av ett visst DNA-fragment. Denna metod utvecklades av Kary Mullis 1983. I denna teknik tjänar DNA-fragmentet som ska amplifieras som mall och DNA-polymerasenzym adderar komplementära nukleotider till primern som är tillgänglig i PCR-blandningen. I slutet av PCR-reaktionen syntetiseras många kopior av prov-DNA.
Det finns olika komponenter i PCR-blandningen, inklusive DNA, DNA-polymeras (Taq-polymeras), primers (framåt och bakåt), nukleotider (byggstenar för DNA) och en buffert. PCR händer inuti en PCR-maskin och rätt PCR-blandning ska laddas i maskinen och rätt program ska köras. Denna teknik möjliggör produktion av tusentals till miljoner kopior av en viss del av DNA från en mycket liten mängd DNA.
PCR-reaktioner inträffar på ett cykliskt sätt för att producera den synliga mängden PCR-produkter på en gel. Det finns tre huvudsteg involverade i en PCR-reaktion, nämligen denaturering, primerglödgning och strängförlängning såsom visas i figur 01. Dessa tre steg uppträder vid tre olika temperaturer. DNA finns i dubbelsträngad form genom vätebindningar mellan de komplementära baserna. Innan implikationen ska dubbelsträngat DNA separeras från varandra. Det görs genom att ge en hög temperatur. Vid hög temperatur dubbelsträngad DNA-denaturering i enkla strängar. Då bör primrarna komma närmare de flankerande ändarna av det specifika fragmentet eller DNA-genen. Primer är en kort bit enkelsträngat DNA som kompletterar målsekvensen. Fram och bak primers glödgas med de komplementära baserna vid de flankerande ändarna av det denaturerade prov-DNA: t vid glödgningstemperaturen. Primers bör vara värmebeständiga. När primrar har glödgat med prov-DNA initierar taq-polymerasenzym syntesen av de nya strängarna genom att tillsätta nukleotider som är komplementära till mål-DNA. Taq-polymeras är ett värmestabilt enzym isolerat från en termofil bakterie som kallas Thermus aquaticus. PCR-buffert bibehåller de optimala förhållandena för taq-polymerasåtgärden. Dessa tre steg av PCR-reaktioner upprepas för att producera den erforderliga mängden PCR-produkt. Efter varje PCR-reaktion fördubblas antalet DNA-kopior. Följaktligen kan en exponentiell förstärkning observeras i PCR. PCR-produkter kan observeras med gelelektrofores och kan renas för ytterligare studier.
Figur 01: Stora steg i en PCR-reaktion
PCR är ett värdefullt verktyg inom medicinsk och biologisk forskning. PCR har ett speciellt värde inom rättsmedicinsk vetenskap eftersom det kan förstärka DNA för studier från de små proverna från brottslingarna och göra rättsmedicinska DNA-profiler. PCR används ofta inom många områden av molekylärbiologi, inklusive genotypning, genkloning, mutationsdetektering, DNA-sekvensering, DNA-mikroarrays och faderskapstest etc.
Figur 02: Polymeraskedjereaktion
Vad är DNA-sekvensering?
DNA-sekvensering är bestämningen av en exakt ordning av nukleotiderna - adenin, guanin, cytosin och tymin i ett givet DNA-fragment. Genetisk information lagras i DNA-sekvenserna med användning av korrekt ordning på nukleotiderna. Det är därför mycket viktigt att hitta den exakta ordningen på nukleotiderna i ett DNA-fragment att veta om genernas struktur och funktion.
DNA-sekvenseringsprotokoll involverar olika processer. Det första steget är isoleringen av intresserad DNA eller genomisk DNA från en organism. Med användning av PCR (som beskrivs ovan) bör den önskade regionen av DNA amplifieras. Amplifierad PCR-produkt bör separeras med gelelektrofores och renas. Förstärkta fragment serveras som mallar för sekvensering. Sekvensering kan göras antingen enligt Sanger-sekvensering eller sekvenseringsmetod med hög kapacitet. Sanger-sekvensering kräver kapillärelektrofores av resulterande DNA-fragment. Bestämning av korrekt nukleotidordning kan göras genom manuell avläsning av autoradiografier eller med hjälp av automatiserade DNA-sekvenser.
Gensekvensering bidrog till humant genomprojekt och underlättade kartläggningen av det mänskliga genomet 2003. I kriminalteknik möjliggjorde DNA-sekvensering identifiering av individer som visar unika DNA-sekvenser och identifierar brottslingarna. Inom medicinen kan DNA-sekvensering användas för att detektera gener som är ansvariga för genetiska och andra sjukdomar, hitta defektgener och ersätta dem med korrekta gener. Inom jordbruket används information om DNA-sekvensering av vissa mikroorganismer för att producera transgena grödor med ekonomiskt önskade egenskaper.
Figur 03: DNA-sekvensering
Vad är skillnaden mellan PCR och DNA-sekvensering?
Skilja artikeln mitt före bordet
PCR vs DNA-sekvensering |
|
| PCR-processen skapar tusentals till miljoner exemplar av det intresserade DNA-fragmentet. | DNA-sekvensering är processen för att bestämma den exakta ordningen på nukleotiderna i ett givet DNA-fragment. |
| Resultat | |
| PCR skapar tusentals till miljoner kopior av ett visst DNA-fragment | Detta resulterar i rätt ordning på baserna i ett visst DNA-fragment. |
| Involvering av ddNTP | |
| PCR kräver inte ddNTP. Den använder dNTP. | DNA-sekvensering kräver ddNTP för att avsluta strängbildning. |
Sammanfattning - PCR vs DNA-sekvensering
PCR och DNA-sekvensering är mycket viktiga verktyg inom många områden av molekylärbiologi. Amplifiering av DNA-fragmenten görs med PCR-tekniken medan den korrekta ordningen på nukleotiderna i ett DNA-fragment bestäms av DNA-sekvenseringen. Detta är skillnaden mellan PCR och DNA-sekvensering.
