Nyckelskillnad - Northern vs Southern vs Western Blotting
Detektion av specifika sekvenser av DNA, RNA och proteiner är viktigt för olika typer av studier inom molekylärbiologi. Gelelektrofores är en teknik som separerar DNA, RNA och proteiner efter deras storlek. Från gelprofilerna detekteras särskild DNA-sekvens, RNA-sekvens eller protein med de speciella tekniker som kallas blotting och hybridisering med märkta sonder. Det finns tre olika typer av blottingmetoder, nämligen södra, norra och västra. Huvudskillnaden mellan norra södra och västra blotting ligger med typen av molekyl som den upptäcker från ett prov. Southern blotting är en metod som detekterar en specifik DNA-sekvens från ett DNA-prov. Northern blotting är en teknik som detekterar en specifik RNA-sekvens från ett RNA-prov. Western blotting är en metod som detekterar ett specifikt protein från ett proteinprov.
INNEHÅLL
1. Översikt och viktig skillnad
2. Vad är Southern Blotting
3. Vad är Northern Blotting
4. Vad är Western Blotting
5. Jämförelse sida vid sida - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Sammanfattning
Vad är Southern Blotting?
Southern blotting-teknik utvecklades av EM Southern 1975 för identifiering av en specifik DNA-sekvens från ett DNA-prov. Detta är den första blottingtekniken som introduceras i molekylärbiologin. Det möjliggjorde detektering av specifika gener från DNA, specifika fragment från DNA, etc. Det finns flera steg involverade i Southern blotting-teknik. De är som följer.
- DNA isoleras från provet och spjälkas med restriktionsendonukleaser.
- Smält prov separeras med Agarosgelelektrofores.
- DNA-fragment i gelén denatureras i enkla strängar genom användning av en alkalisk lösning.
- Enkelsträngat DNA överförs till ett nitrocellulosafiltermembran genom kapilläröverföring.
- Överfört DNA fixeras permanent på membranet.
- Fast DNA på membranet hybridiseras med märkta sonder.
- Obundet DNA tvättas bort från membranet genom tvättning.
- Röntgenfilm exponeras för membranet och en autoradiograf framställs.
Southern blotting används för olika aspekter av molekylärbiologi. Det är användbart vid RFLP-kartläggning, kriminaltekniska studier, DNA-metylering i genuttryck, detektion av muterade gener vid genetiska störningar, DNA-fingeravtryck etc.
Figur 01: Southern Blotting-teknik
Vad är Northern Blotting?
Northern blotting är en metod utformad för att detektera en specifik RNA-sekvens eller mRNA-sekvens från ett prov för att studera genuttryck. Denna teknik utvecklades av Alwine, Kemp och Stark 1979. Den skiljer sig från sourthern och western blotting-tekniker på grund av flera steg. Emellertid utförs denna teknik också via gelelektrofores, blotting och hybridisering med specifika märkta sonder och detektering. Northern blotting-teknik utförs enligt följande.
- RNA extraheras från provet och separeras genom gelelektrofores.
- RNA överförs från gelén till ett blottingmembran och fixeras.
- Membranet behandlas med en märkt sond framställd av cDNA eller RNA (sonden är komplementär till en specifik sekvens i provet).
- Sonden inkuberas med membranet för att binda med en specifik sekvens.
- Obundna sonder tvättas av.
- Hybridiserade fragment detekteras med en autoradiograf.
Northern blotting är ett viktigt verktyg för detektion och kvantifiering av hybridiserat mRNA, studier av RNA-nedbrytning, utvärdering av RNA-halveringstid, detektion av RNA-splitsning, studier av genuttryck, etc.
Figur 02: Northern Blotting
Vad är Western Blotting?
Western blotting är en metod för att detektera ett specifikt protein från en proteinblandning med användning av märkt antikropp. Därför är Western blot också känt som en immunoblot. Denna teknik introducerades av Towbin et al 1979 och den utförs nu rutinmässigt i laboratorierna för proteinanalys. Stegen är som följer.
- Proteiner extraheras från provet
- Proteiner separeras genom sina storlekar med användning av polyakrylamidgelelektrofores
- Separerade molekyler överförs till ett PVDF-membran eller nitrocellulosamembran genom elektroporation
- Membranet blockeras för ospecifik bindning med antikropparna
- Överförda proteiner är bundna med primär antikropp (enzymmärkta antikroppar).
- Membranet tvättas för att avlägsna icke-specifikt bundna primära antikroppar
- Bundna antikroppar detekteras genom att tillsätta ett substrat och detektera den bildade färgade fällningen
Western blotting är användbar vid detektion av anti-HIV-antikroppar i ett humant serumprov. Western blot kan också användas som ett bekräftande test för hepatit B-infektion och definitivt test för galna ko-sjukdomar.
Figur 03: Western Blotting
Vad är skillnaden mellan norra södra och västra blotting?
Skilja artikeln mitt före bordet
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Typ av molekyl upptäckt | |
| Northern Blotting | Northern blotting detekterar en specifik RNA-sekvens från ett RNA-prov. |
| Southern Blotting | Southern blotting detekterar en specifik DNA-sekvens från ett DNA-prov. |
| Western Blotting | Western blotting upptäcker ett specifikt protein från ett proteinprov. |
| Typ av gel | |
| Northern Blotting | Detta använder Agarose / formaldehydgel. |
| Southern Blotting | Detta använder en Agarosgel. |
| Western Blotting | Detta använder polyakrylamidgel. |
| Blotting Metod | |
| Northern Blotting | Detta är en kapilläröverföring. |
| Southern Blotting | Detta är en kapilläröverföring. |
| Western Blotting | Detta är en elektrisk överföring. |
| Sonder används | |
| Northern Blotting | cDNA- eller RNA-sonder märkta radioaktivt eller icke-radioaktivt. |
| Southern Blotting | DNA-sonder är märkta radioaktivt eller icke-radioaktivt. |
| Western Blotting | Primära antikroppar används som sonder. |
| Detektionssystem | |
| Northern Blotting | Detta görs med hjälp av en autoradiograf eller detektering av ljus eller färgförändring. |
| Southern Blotting | Detta görs med hjälp av en autoradiografi, detektering av ljus eller färgförändring. |
| Western Blotting | Detta görs med hjälp av detektering av ljus eller färgförändring. |
Sammanfattning - Northern vs Southern vs Western Blotting
Blotting är en speciell teknik utvecklad för identifiering av specifikt DNA, RNA eller protein från proverna. Det finns tre separata blottingprocedurer, nämligen norra, södra och västra, för att detektera en specifik typ av molekyl. Northern blotting-tekniken är utformad för att detektera en specifik RNA-sekvens från en blandning av RNA. Southern blotting-teknik möjliggör detektion av en specifik DNA-sekvens från ett DNA-prov och western blotting-teknik utvecklas för att identifiera ett specifikt protein från en proteinblandning.
