Nyckelskillnad - Microarray vs RNA-sekvensering
Transkriptom representerar hela innehållet av RNA närvarande i en cell inklusive mRNA, rRNA, tRNA, nedbrutet RNA och icke-nedbrutet RNA. Profilering av transkriptom är en viktig process för att förstå cellinsikterna. Det finns flera avancerade metoder för transkriptomprofilering. Microarray och RNA-sekvensering är två typer av teknologier som utvecklats för att analysera transkriptom. Huvudskillnaden mellan mikroarray och RNA-sekvensering är att mikroarray baseras på hybridiseringspotentialen för förutformade märkta prober med mål-cDNA-sekvenser medan RNA-sekvensering baseras på direkt sekvensering av cDNA-strängar genom avancerade sekvenseringstekniker såsom NGS. Microarray utförs med förkunskaper om sekvenserna och RNA-sekvensering utförs utan förkunskap om sekvenser.
INNEHÅLL
1. Översikt och nyckelskillnad
2. Vad är mikroarray
3. Vad är RNA-sekvensering
4. Jämförelse sida vid sida - Microarray vs RNA-sekvensering
5. Sammanfattning
Vad är Microarray?
Microarray är en robust, tillförlitlig och hög genomströmningsmetod som används för transkriptomprofilering av forskare. Det är den mest populära metoden för transkriptionsanalys. Det är en billig metod som beror på hybridiseringsproberna.
Tekniken börjar med extraktion av mRNA från provet och konstruktion av cDNA-bibliotek från totalt RNA. Därefter blandas den med fluorescerande märkta förutformade prober på en fast yta (punktmatris). Kompletterande sekvenser hybridiserar med de märkta sonderna i mikroarrayen. Därefter tvättas och screenas mikroarray och bilden kvantifieras. Insamlad data bör analyseras för att få de relativa uttrycksprofilerna.
Intensiteten hos mikroarraysonderna antas vara proportionell mot mängden avskrifter i provet. Noggrannheten för tekniken beror dock på de designade sonderna, förkunskaper om sekvensen och affiniteten hos sonder för hybridisering. Därför har mikroarrayteknik begränsningar. Microarray-teknik kan inte utföras med transkript med lågt överflöd. Det misslyckas med att differentiera isoformer och identifiera genetiska varianter. Eftersom denna metod beror på hybridisering av sonder, förekommer vissa problem relaterade till hybridisering såsom korshybridisering, ospecifik hybridisering etc. i mikroarrayteknik.
Figur 01: Microarray
Vad är RNA-sekvensering?
RNA hagelgevärssekvensering (RNA seq) är en nyligen utvecklad sekvenseringsteknik för hel transkriptom. Det är en snabb och hög genomströmningsmetod för transkriptionsprofilering. Det kvantifierar direkt uttrycket av gener och resulterar i djup undersökning av transkriptomen. RNA-sekvensen beror inte på förutbestämda prober eller förkunskaper om sekvenserna. Därför har RNA seq-metoden hög känslighet och förmåga att detektera nya gener och genetiska varianter.
RNA-sekvenseringsmetod utförs via flera steg. Total RNA i cellen måste isoleras och fragmenteras. Sedan, med användning av omvänd transkriptas, måste ett cDNA-bibliotek förberedas. Varje cDNA-sträng måste ligeras med adaptrar. Sedan måste de ligerade fragmenten amplifieras och renas. Slutligen med en NGS-metod måste sekvensering av cDNA utföras.
Figur 02: RNA-sekvensering
Vad är skillnaden mellan Microarray och RNA-sekvensering?
Skilja artikeln mitt före bordet
Microarray vs RNA-sekvensering |
|
| Microarray är en robust, pålitlig metod för hög kapacitet. | RNA-sekvensering är en noggrann och hög genomströmningsmetod. |
| Kosta | |
| Detta är en billig metod. | Detta är en dyr metod. |
| Analys av ett stort antal prover | |
| Detta underlättar analys av ett stort antal prover samtidigt. | Detta underlättar analys av ett stort antal prover. |
| Dataanalys | |
| Dataanalys är komplex. | Mer data genereras i denna metod; därför är processen mer komplex. |
| Tidigare kunskap om sekvenser | |
| Denna metod är baserad på hybridiseringsprober, så förkunskaper om sekvenser krävs. | Denna metod beror inte på tidigare sekvenskunskap. |
| Strukturella variationer och nya gener | |
| Denna metod kan inte upptäcka strukturella variationer och nya gener. | Denna metod kan detektera strukturella variationer såsom genfusion, alternativ skarvning och nya gener. |
| Känslighet | |
| Detta kan inte detektera skillnader i uttryck av isoformer, så detta har begränsad känslighet. | Detta har hög känslighet. |
| Resultat | |
| Detta kan bara resultera i relativa uttrycksnivåer. Detta ger inte absolut kvantifiering av genuttryck. | Det ger absoluta och relativa uttrycksnivåer. |
| Data omanalys | |
| Detta måste göras om för att analysera om. | Sekvenseringsdata kan analyseras om. |
| Behov av specifik personal och infrastruktur | |
| Specifik infrastruktur och personal krävs inte för mikroarray. | Specifik infrastruktur och personal som krävs av RNA-sekvensering. |
| Tekniska problem | |
| Microarray-tekniken har tekniska problem som korshybridisering, ospecifik hybridisering, begränsad detekteringshastighet för enskilda sonder etc. | RNA seq-teknik undviker tekniska problem som korshybridisering, ospecifik hybridisering, begränsad detekteringshastighet för enskilda sonder etc. |
| Fördomar | |
| Detta är en partisk metod eftersom den beror på hybridisering. | Bias är låg jämfört med mikroarray. |
Sammanfattning - Microarray vs RNA-sekvensering
Microarray- och RNA-sekvenseringsmetoder är plattformar med hög kapacitet utvecklade för transkriptomprofilering. Båda metoderna ger resultat som är starkt korrelerade med genuttrycksprofiler. Emellertid har RNA-sekvensering fördelar jämfört med mikroarray för genuttrycksanalys. RNA-sekvensering är en mer känslig metod för detektering av transkript med låg förekomst än mikroarray. RNA-sekvensering möjliggör också differentiering mellan isoformer och identifiering av genvarianter. Microarray är dock det vanligaste valet för de flesta forskare eftersom RNA-sekvensering är en ny och dyr teknik med datalagringsutmaningar och komplex dataanalys.
